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針對樣品的常見問題：
Q：細胞水平要做Western Blot，多少細胞提的蛋白夠Western Blot？
A：一般地5* 106就足夠了。
Q: 同一樣品能同時提RNA又提蛋白嗎，這樣對Western Blot有無影響?
A：能，沒有問題的。
Q: 同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測嗎？
A：當然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。
Q: 如果目標蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么？
A: 如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑就要溫和得多，這時建議加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
Q: 蛋白變性后可以存放多久？
A：－80℃，一兩年沒有問題。zui關鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細菌消化掉(也是被酶水解了)。
Q: 如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？如果需要加大上樣量使原來弱的條帶能看清楚。
A：可以濃縮樣品，也可以根據你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會有問題的。如果已經超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm厚度的凝膠。
Q: 接下來我準備采用DAB顯色技術，二抗是生物素化的多克隆抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調整，能否再用5％的脫脂奶粉呢？好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的生成，是嗎？
A：不能使用脫脂奶粉，因為脫脂奶粉中含生物素，用BSA代替應該好一點，此外如果用于磷酸化指標蛋白的檢測時也不能用脫脂奶粉，因為脫脂奶粉中含有酪蛋白。
Q：一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達量有關系嗎？
A：Western Blot一般上樣30－100微克不等，結果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和孵育時間都有關系，也與顯色時間長短有關。開始摸條件時，為了拿到陽性結果，各個步驟都可以量多一點時間長一點，當然背景也就出來了。要拿到好的結果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復地試了，當然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。所以拿到好的結果不容易。
Q: 做組織樣品的western的時候，處理樣品有什么訣竅嗎？還有，您用過大牛血清做封閉劑嗎？濃度如何？效果是不是比BSA好一點？
A：組織樣品必須進行研磨、勻漿超聲處理，蛋白質溶解度會更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入PMSF和蛋白酶抑制劑 cocktail），封閉劑一般5%脫脂奶粉較常用。如果一抗為多克隆抗體，使用BSA也是不錯的選擇。
Q: 大分子量蛋白200 kD，在做western要注意什么呢？
A：做200kd蛋白的Western Blot時要注意，分離膠建議選擇>7%的；剝膠時要小心；轉移時間需要相應延長；要做分子量參照（否則出現雜帶不知道如何分析）。
Q：蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求？
A：上樣量要根據實驗的要求來定， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等， 如果只是要定性，則沒有太大的關系， 盡量多上就行了， 但是不要超過0.3μg/mm2。
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