免疫組化的實驗步驟剖析（一）

1、標本固定：固定的目的是：  

        ①，防止標本從玻片上脫落；

        ②，除去防礙抗原—抗體結合的類脂，使抗原抗體結合物易于獲得良好的染色結果；

        ③，固定的標本易于保存。固定劑的選擇一般用 4%多聚甲醛。

2、脫水、石蠟包埋和制片：脫水用梯度乙醇（由低到高）充分脫水、對組織要*浸蠟、切片時刀片要干凈和鋒利。否則容易裂片和脫片等。

3、脫蠟和水化：這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結合反應。脫蠟可以先60度20min，然后立即二甲苯1-3分別10min，但當天制好的切片可以60度3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脫蠟和水化不全易出現局灶性反應和浸洗不全，而產生非特異性背景著色。

4、抗原修復：由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發生了蛋白之間交聯及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；因此要進行抗原修復。通過抗原修復，使得細胞內抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。常用的修復方法從強到弱一般分為三種，高壓修復、微波修復、胰酶修復。修復液也分為若干種（具體的可以查閱相關資料）。

5、細胞通透：目的是使抗體能夠充分地進入胞內進行結合反應。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如TritonX-100可以溶解細胞膜、細胞核膜、細胞器膜上的脂質而使抗體及大分子結構的物質進入胞漿和胞核內，這樣抗體就能順利進入胞內與相應抗原結合。

6、滅活內源性過氧化物酶和生物素：在傳統的ABC法和SP法中，免疫組化反應結果容易收到內源性過氧化物酶和生物素的干擾，必須用過氧化氫和卵白素等進行滅活。滅活內源性POD一般3%過氧化氫滅活時間短點，而0.3%過氧化氫則可以適當延長封閉時間。

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