Western blot發光檢測中常見的問題及解決方法

*，Western blot的原理是蛋白質在電力場的作用下，由大到小的進行排列，利用電泳進行分離和富集。擁有抗原表位的蛋白質分子被抗體（一抗）特異性識別并與之結合。在此基礎上，酶或熒光標記的二抗識別并結合一抗，通過與底物反應顯色來觀察目的蛋白。

 

     一、放射自顯影；

     二、 底物化學發光ECL；

     三、底物熒光ECF；

     四、底物DAB呈色。

 

現常用的有底物化學發光ECL和底物DAB呈色。大部分Western blot顯色底物是化學發光底物，發表文章通常也是用底物化學發光ECL。

 

ECL法檢測辣根過氧化物酶的原理是辣根過氧化物酶在H2O2存在下，氧化化學發光物質魯米諾（lumino，氨基苯二酰一肼）并發光，在化學增強劑存在下光強度可以增大1000倍，通過將印記放在照相底片上感光就可以檢測辣根過氧化物酶的存在。ECL法操作簡便，應用現成的試劑盒(abs920)，按照說明，將兩種顯色底物等體積混合后將其覆蓋在膜表面使其均勻，用玻璃膠片把膜包起來，馬上在暗室中將X光片覆蓋在膜的上面，顯影、定影（或用熒光檢測儀檢測）。ECL法具有靈敏度高，線性范圍廣等特點。